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Molecular Catalysis：腈水合酶的激活蛋白的研究进展

分类：行业动态

发布时间：2024-09-23 10:36
访问量：

【概要描述】腈水合酶（NHase, EC 4.2.1.84）是一种非常有价值的生物催化剂，能够在温和的条件下将腈类化合物转化为相应的酰胺类化合物。

Molecular Catalysis：腈水合酶的激活蛋白的研究进展

分类：行业动态
发布时间：2024-09-23 10:36
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腈水合酶（NHase, EC 4.2.1.84）是一种非常有价值的生物催化剂，能够在温和的条件下将腈类化合物转化为相应的酰胺类化合物。

很多研究团队通过计算和实验研究解析了腈水合酶的催化机制，截至目前，仍存在较大的争议。现阶段被大家广泛接受的催化机制主要有以下四种：

1. 腈水合酶的催化机制

其中三种催化机制a-c均建立在推测之上，并没有直接的、强有力的依据。而催化机制d则是通过解析腈水合酶复合物的晶体结构发现的，在PtNHase中，被氧化为半胱氨酸-次磺酸的第113位氨基酸残基作为亲核试剂可以直接攻击与金属离子配位的底物，并形成共价结合的酰亚胺中间体，一旦发生质子转移，过渡态产物酰亚胺上的碳原子(pathway B)或αCys113(pathway A)在受到水分子的亲核攻击时，酰亚胺最终异构化为酰胺。

利用腈水合酶作为生物催化剂生产的酰胺类产品在工业、农业及医药等领域有着极大的应用价值。目前，腈水合酶可用于生产丙烯酰胺和烟酰胺等小体积酰胺化合物，这类化合物已作为大宗化学品广泛使用。未来，腈水合酶还可用于合成大体积酰胺类化合物，这类化合物通常是高价值药品的原料及医药中间体，具体图2所示：

图2. 高价值酰胺类化合物及应用

腈水合酶基因簇上的激活蛋白能够促进NHase的成熟，从而影响NHase的催化能力。本篇综述概述了激活蛋白在机制、能量利用、灵活性和表达等方面的最新研究进展。

一、激活蛋白促进NHase成熟的机制

来自不同微生物的NHase基因簇排列方式不同，不同的基因排列方式会呈现出NHase成熟的不同机制，文中展现了多种编码NHase基因的基因簇，如图3所示，其中编码NHase的典型基因簇为图3A和图3B。NHase的成熟需要NHase形成结合金属的活性中心，NHase基因簇表达出的激活蛋白主要负责捕获金属离子并运输到活性中心，通过亚基之间的调整，从而激活NHase。

图3. 不同NHase基因簇的组成

本篇综述将激活蛋白促进NHase成熟的机制分为两种，一种是借助激活蛋白的自然成熟机制，另一种是通过亚基融合的成熟机制。

在NHase自然成熟机制中，根据活性中心结合的金属离子差异，NHase又可分为Co-NHases和Fe-NHases。本综述论述了如图4A-F所示的5种自然成熟机制，图中蓝色的球代表了Fe离子，紫色的球代表了Co离子，激活蛋白用‘γ’表示。详细的自然成熟机制如表1所示，表中提及的“亚基自身交换”指的是通过α-亚基上去质子化的Cys-SO^2-、Cys-SO-和β-亚基上的两个精氨酸(R52和R157)之间的盐桥作用实现亚基自身交换。

图4. NHase的成熟机制

表1. NHase的自然成熟机制

表2. NHase亚基融合的成熟机制

二、激活蛋白在金属离子转运过程中充当NTPase的角色

大多数的金属运输过程是和能量耦合的，这就意味着某些酶的激活需要核苷酸水解酶（NTPase）的参与。通过分析激活蛋白的结构和功能，发现激活蛋白具有NTPase功能，该功能能够促进金属离子的吸收和运输，导致NHase活化。

Fe-NHase具有G3E P-loop结构域，该结构域为GTPase的结构特征，同时GTPase属于G3E NTPase家族，所以根据Fe-NHase结构确定Fe-NHase具有NTPase功能，能够结合并水解三磷酸鸟苷(GTP)。Co-NHase的基因和结构与Fe-NHase相似性很低，呈现出了ATPase(水解ATP)以及GTPase活性，其中ATPase活性更高。

Fe-NHase金属酶的成熟过程如图5所示：激活蛋白首先与α-亚基之间形成络合物，然后GTP可以帮助铁离子结合到α-亚基，加速了腈类物质的水合作用。最后，通过“亚基自身交换”，实现成熟的α-亚基替代脱辅基α-亚基。

图5. 在Fe-NHase成熟过程中G3E P-loop GTPase的假设作用

在某些条件下金属离子的引入不需要额外的能量，NHase能够自发激活金属所在的活性中心的特定状态时，不需要NTP；体内NTP以分子伴侣蛋白的作用促使NHase重新折叠成活性状态时，NHase也不需要体外提供能量的NTP。

三、NHase激活蛋白的灵活性

NHase激活蛋白的灵活性分为作用机制灵活性和位点灵活性。激活蛋白的作用机制灵活性又分为① NHase基因簇内不同的基因排列意味着NHase的不同的自然成熟机制或亚基融合后的成熟机制；② NHase在体内和体外会采用不同的成熟机制，将来源于R. rhodochrous J1的脱辅基NHase、脱辅助因子的激活蛋白和钴离子在体外混合后，得到低活性的NHase，在相同的情况下，NHase在体内却具有活性；③ 激活蛋白在NHase成熟中扮演了分子伴侣蛋白、金属伴侣、NTPase等多种角色，如图6所示。

图6. 激活蛋白在NHase成熟中扮演的角色

NHase激活蛋白具有多种功能，每种功能在激活蛋白上有不同的结合位点。此外，激活蛋白的分子量较低，所以他具有一定程度的位点灵活性，特别是Co-NHase的激活蛋白。利用点突变更改了激活蛋白中的保守位点后，一些激活蛋白突变体并不会影响NHase的活性。更改激活蛋白的α-螺旋后，NHase的活性显著下降。所以激活蛋白具有相对的位点灵活性和结构依赖性。

根据激活蛋白具有的位点灵活性和结构依赖性，可以判断NHase激活蛋白是通过具有一定特征的结构促进半胱氨酸氧化，从而激活NHase。

四、NHase激活蛋白的表达

NHase激活蛋白的表达水平受到调节因子，碳源代谢物，金属离子，低营养水平和基因融合等因素的影响。

文章来源：

作者信息：周哲敏：http://biotech.jiangnan.edu.cn/szdw1/jzyg/zg1/zzm.htm

研究方向：发酵工程、酶催化转化。

原文链接：http://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S2468823124004905?via%3Dihub.

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